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技術(shù)文章
更新時(shí)間：2025-03-21
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EZB彩色qPCR試劑盒是專(zhuān)為多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR設(shè)計(jì)的全預(yù)混體系，包含優(yōu)化濃度的ROX2被動(dòng)參比染料，適配ABI 7500、Bio-Rad CFX96等多品牌qPCR儀。核心優(yōu)勢(shì)包括：
·2×預(yù)混Master Mix：整合HotStart Taq酶、dNTPs及反應(yīng)緩沖液
·高兼容性：支持SYBR Green I、EvaGreen及TaqMan探針檢測(cè)
·擴(kuò)增效率：標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示≥98%擴(kuò)增效率(R²值>0.99)
貨號(hào)：A0012-R2
包裝規(guī)格：1 mL(50次反應(yīng)) / 5 mL(250次反應(yīng))
ROX濃度：預(yù)混0.3X ROX2(適配多數(shù)機(jī)型光學(xué)校準(zhǔn)需求)
適用樣本：DNA(≥1 ng/μL)、cDNA(稀釋比1:5-1:20)
保存條件：-20℃避光保存(避免反復(fù)凍融>5次)
有效期：生產(chǎn)日期起18個(gè)月
1. 反應(yīng)體系配置
| 組分 | 體積（μL） |
| 2× qPCR Master Mix | 10 |
| 正向引物（10 μM） | 0.4 |
| 反向引物（10 μM） | 0.4 |
| 模板DNA | 1-5 |
| ddH?O | 補(bǔ)至20 |
2. 程序設(shè)置（兩步驟法）
①預(yù)變性：95℃ 3分鐘（激活HotStart酶）
②循環(huán)階段（40 Cycles）：
·95℃ 15秒（變性）
·60℃ 30秒（退火/延伸，FAM通道采集熒光）
③熔解曲線（選做）：
65℃→95℃，每0.5℃遞增，駐留5秒
3. 數(shù)據(jù)判讀
·Ct值閾：建議設(shè)置于熒光信號(hào)指數(shù)增長(zhǎng)1/3處
·熔解曲線：?jiǎn)畏逄崾咎禺愋詳U(kuò)增（Tm值波動(dòng)≤1.5℃為正常）
1. 基因組DNA定量（人類(lèi)GAPDH基因）
·模板量：10 ng DNA
·引物濃度：0.2 μM
·結(jié)果判讀：Ct值＜28（3次重復(fù)CV≤1.5%）
2. 病毒RNA檢測(cè)（甲流H1N1）
·反轉(zhuǎn)錄整合：直接使用cDNA（試劑盒兼容預(yù)混RT-qPCR體系）
·探針濃度：TaqMan探針0.5 μM
·靈敏度：檢測(cè)下限達(dá)10 copies/μL
3. 細(xì)菌表達(dá)分析（大腸桿菌16S rRNA）
·抑制劑處理：添加1% BSA消除腐殖酸干擾
·梯度稀釋：標(biāo)準(zhǔn)曲線R²值需≥0.995
| 問(wèn)題現(xiàn)象 | 潛在原因 | 解決方案 |
| 擴(kuò)增曲線平臺(tái)期低 | 模板降解或引物二聚體 | 更換新批次引物 + DNase處理模板 |
| 陰性對(duì)照出現(xiàn)Ct值 | 氣溶膠污染 | 啟用UNG防污染系統(tǒng)（貨號(hào)A0021） |
| 熔解曲線出現(xiàn)多峰 | 非特異性擴(kuò)增 | 提升退火溫度至62℃，縮短延伸時(shí)間 |
| ROX校正信號(hào)異常 | 分裝凍融次數(shù)過(guò)多 | 新解凍試劑 + 校準(zhǔn)儀器光路 |
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